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引物tm值太低

引物TM是设值和合成引物时的Tm值, 也就是理论值. 而PCR产物tm值是在实际操作中摸索出来的温度值 引物Tm值与PCR产物Tm值这两个不同的引物当然退火温度也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出Tm值是多少.在做PCR的时候,将退火温度设定的稍.

Tm较低,而且熔解温度范围较宽;离子强度较高时,Tm较高,熔解温度范围较窄.DNA溶液中离子强度低时,Tm较低,而且熔解温度范围较宽;离子强度较高时,Tm较高,熔解温度范围较窄.因此,在表示某一来源DNA的Tm值时,必须指出

引物的Tm值低,那么你反应程序的退火温度就要相应的调低,不然扩增会失败.退火温度变低,引物就容易结合到不完全匹配的模板序列上,从而导致非特异性扩增

!!gyesang(站内联系TA)你PCR的模板是什么?你做PCR的目的是什么?设计引物的时候,上下游引物的GC含量相差尽量 不要太大,你接下来可以试下touchdown.意孤城_(站内联系TA)如果不想麻烦就touchdown PCR,如果求稳当设置梯

tm是50%解链,那么退火要复性,必然不能只有一半的DNA复性,所以温度低一点,就能使引物充分与模板链结合了.

那就扩增不出来了呗~

引物tm是设值和合成引物时的tm值,也就是理论值.而pcr产物tm值是在实际操作中摸索出来的温度值引物tm值与pcr产物tm值这两个不同的引物当然退火温度也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出tm值是多少.在做pcr的时候,将退火温度设定的稍微低于tm值一点,降低引物的特异性,可能会好点.当然,做pcr有一定的运气成分,同样的条件有时能扩出基因来,有时候却不能.一般来说,一直无法p出基因的话,首先就要检查引物设计是否有问题,如果没有问题,或者以前p出来过.那么检查下退火温度,多试几个温度.再就是mg离子的浓度,模板不要太多.多尝试一下.总之,设定退火温度的时候略微比tm低一点,适当的调整,多多尝试,就好了.

退火温度与引物的TM值的关系主要和DNA聚合酶与其buffer有关.有些退火温度要比TM低5度、3度,有些还会高3度,有些是一模一样的.主要参考不同公司所生产的DNA聚合酶的说明书.

我给你理一下思路哈~ 首先,你用设计的引物做第一轮pcr的时候,产物扩出来了. 该产物是否测序?或者你只是用marker估算了一下. 然后,你把该pcr产物进行下一轮扩增,没有条带: 1.第二轮pcr的问题: a你加的pcr模板会不会太多,只要不是几十几百ng,问题还是不大的 b你第二轮设计的引物有没有问题? 2.第一轮pcr的问题: a你第一轮设计的引物有没有问题,会不会出现非特异性扩增? b第一轮到第二轮之间有没有什么操作影响了扩增(有的话,再分析这个) 3.整个pcr的问题: a你要扩增的片段是否有问题?是否GC含量过高等 b确认试剂和酶

退火温度一般是TM值减10度,不过实践证明低些也能扩出来,我就扩过TM在80左右的,退火温度没超过60度就扩出来了.另外,不知你用什么软件分析的TM值,不同的软件好像算法不太一样.

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